MDL科研助手2023-11-1617:00河北

1、細胞準備

（1）取出生長狀態(tài)良好的細胞，棄培養(yǎng)基，消化重懸細胞。

（2）將24孔圓形爬片放入24孔板的孔中。

（3）根據(jù)細胞生長特性取適量細胞于已鋪爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培養(yǎng)。

2、固定

（1）取出細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3次。

（2）每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室溫固定10-20min，棄去多聚甲醛；

（3）加入1mL的PBS清洗細胞，重復兩次。

3、通透

（1）每孔加入1mL的0.5%Triton-X100，室溫10min，棄去Triton-X100。

（2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復兩次。

4、封閉

每孔中加入1mL的3%BSA封閉液，室溫封閉1h。棄封閉液。

5、一抗結(jié)合

（1）向爬片上滴加稀釋好的一抗，用錫箔紙包住24孔板外面，輕柔的將24孔板放置于4℃冰箱中，過夜孵育。

（2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

6、二抗結(jié)合

（1）加封閉液稀釋的二抗室溫避光孵育1h。

（2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復五次。

7、DAPI染色

（1）按照1：4000比例用1×PBS稀釋DAPI工作液（參照廠家說明書），并向每個孔中加入1mL的DAPI工作液，避光靜置染色10min。

（2）加入1mL的PBS清洗細胞，5min，棄PBS。重復三次。

8、封片及檢測

（1）將爬片小心取出，用吸水紙吸干多余液體，加5μl的抗熒光淬滅劑到載玻片上。

（2）將爬片倒置載玻片上，周圍涂指甲油固定。

（3）4℃暫存或直接激光共聚焦顯微鏡拍攝。